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一种使用低温冷却液循环泵对植物体内源肽的提取方法
科瑞仪器 / 2019-04-26 16:02/ QQ在线报价

一种使用低温冷却液循环泵对植物体内源肽的提取方法
技术领域
[0001]本发明属于植物体肽提取技术领域,特别涉及一种植物体内源肽的提取方法。
背景技术
[0002]肽是由天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称,通常由2到100个氨基酸组成。肽是通过肽键的不可逆水解从较大的(蛋白质)前体中产生的。与蛋白质相比,肽不仅比蛋白质更易消化吸收,还具有促进免疫、调节激素、抗菌、抗病毒、降血压和降血脂等生理机能。陆地植物种类繁多,充分利用廉价的植物肽资源开发具有高附加值的肽产品,可产生巨大的经济效益和社会效益。
[0003]肽组学是近年来发展起来的蛋白质组学的一个分支,主要研究动物的神经肽和蛋白酶的降解,但是肽组学在植物科学中还是一个相对较新的领域,在未来几年它可能有助于阐述多肽组。植物肽是小于lOkDa的蛋白质分子,本质上可分为两类:一类是由肽酶在较大前体蛋白上的选择性作用中产生的生物活性肽,另一类是蛋白水解酶在蛋白周转过程中产生的降解肽。鉴于生物系统中多肽的高度多样性及其在关键调控过程中的参与,改进多肽发现的需求已经出现,因此,开发了针对样品制备、质谱分析检测、序列测定和通过比较不间实验装置的肽谱进行鉴别分析的特异性肽段技术。
[0004]多肽种类繁多,几乎参与生物体的生长、发育、免疫、新陈代谢等各个环节。机体内存在的内源肽具有重要的功能,例如在人和动物中发现的肽具有促进免疫、调节激素、抗菌、抗病毒、降血压和降血脂等生物学功能。肽在植物的研究较少,目前发现的多肽在植物生长发育、生殖、共生互作和压力响应方面具有重要的功能。一方面,肽可以通过其抗菌特性直接和病原菌相互作用;另一方面,肽可以干扰信号分子或作为信号分子在植物细胞间信号传递中起到重要作用。尽管在植物中发现的肽越来越多,它们的功能也得到了初步解析,但是在基因预测和质谱分析中肽往往被忽略掉。
[0005]此外,植物内源多肽的获得是鉴定和研究内源多肽的基础,目前提取植物体内源肽的主要方法有两种:一种是酸提取法;另一种是酸提取缓冲液与植物蛋白酶抑制剂的混合物。但是这两种方法的通量都不高,而且近年来研究发现,加入蛋白酶抑制剂并不能很好的抑制植物体内蛋白酶的活性。因此,探究一种高效、快捷、重复性好的植物体内多肽的提取方法十分必要。
发明内容
[0006]本发明的目的在于,针对现有植物体内多肽提取存在的上述问题,提供一种植物体肉源肽的提取方法。
[0007]为了实现上述目的,本申请采用的技术方案为:
[0008]一种植物体内源肽的提取方法,包括如下步骤:
[0009]利用液氮将放置在研钵中的植物组织冰冻后,研磨成粉末,并将粉末装入离心管中,待用;
[0010]将装有粉末的离心管置于94.5。C~95.5。C的水浴中加热4min~5min后,待用;
[0011]再向粉末中加入TCA和丙酮的混合溶液,所述粉末与混合溶液的比例为lg:5mL~7mL;沉淀4.5h--5.5h后,3。C~5。C且9000r/min~llOOOr/min下离心18min~22min,收集沉淀物,待用;
[0012]将沉淀物用预冷的丙酮洗涤至无色后,将沉淀物复溶于溶解有蛋白酶抑制剂的TFA水溶液,且所述TFA水溶液中TFA的体积分数为1%;所述沉淀物与TFA水溶液的比例为lg:4mL~6mL,所述TFA水溶液与蛋白酶抑制剂的比例为ImL:4uL~6uL;然后于3。C~5。C下孵育0. 8h~1.2h,得到第一混合溶液,待用;
[0013]再将第一混合溶液通过低温冷却液循环泵降温下超声裂解4min~5min,得到第二混合溶液,待用,其中超声功率为40W,每超声5.5s~6.5s停止超声7.5s~8.5s,裂解温度为4。C~IO。C;
[0014]再将所述第二混合溶液在3。C~5。C且9000r/min~llOOOr/min下离心18min~22min,得到上清液,待用;[0015]再将历述上清液过lOkD的超滤管,得到的超滤液即为含有植物体内源肽的提取液;
[0016]将含有植物源内源肽的提取液脱盐处理后,真空干燥,得到肽段。
[0017]进一步的,所述植物组织为植物叶片。
[0018]进一步的,所述植物叶片为新鲜的玉米叶片。
[0019]进一步的,所述TCA和丙酮的混合液,其中丙酮与TCA的比例为lOmL:lg。
[0020]进一步的,所述预冷的丙酮的温度为4。C~IO。C。
[0021]与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明的方法在肽分离之前进行水浴加
热和沉淀,其中水浴加热能够使植物蛋白变性失活,抑制蛋白降解,保持生理状态下的多
肽,促进多肽释放溶解;而TCA/丙酮沉淀能够促进大量次生化合物的溶解,同时沉淀蛋白
质,而且去除干扰物质;且本发明方法操作简便,并且有效的保留植物体内天然长链肽,因
此本发明的提取方法产率稿,获得的肽段数目多,且肽段长度长。
附图说明
[0022]图1是本发明实施例1的肽段得分分布图;
[0023]图2是本发明实施例1的肽段长度分布图;
[0024]图3是本发明对比例1的肽段得分分布图;
[0025]图4是本发明对比例1的肽段长度分布图。
具体实施方式
[0026]内了使本发明的技术手段、创作特征、达到目的与功效易于明白了解,下面将结合本发明的具体实施例和附图,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0027]非标记定量多肽组学近年来成为重要的质谱定量方法,按照其原理分,主要有两种。其中spectrum counts类的非标记定量方法,发展比较早,也形成了多种算法进行定量,但是主要的原理都是根据MS2的鉴定结果作为定量的基础,各种方法的差别在于后期算法
在大规模数据上的修正。第二种非标记定量方法的原理是以MS1为基础,计算每个肽段信号在LC-MS色谱上的积分,这个也是本申请的以下实施例中所采用Maxquant算法的原理。
[0028]Maxquant,是领先的蛋白质组学/多肽组学定性定量算法,现在已经渐渐成为蛋白质组学/多肽组学领域内的标准解决方案之一。采用Maxquant中的Labelfree算法对蛋白质组学/多肽组学数据进行非标记定量计算,也成为此算法的重要应用。Maxquant既可以对
SILAC标记的蛋白质组学/多肽组学数据进行分析,同时也可以对非稳定同位素标记的数据进行分析。其中的Labelfreequantification (LFQ)算法,简单的来说,首先是对每个LCMS数据中的肽段信号进行识别并定量,然后使用内置的Andromeda算法对所有肽段信号MS2进
行数据库检索,完成定性工作,最后整合所有的定性定量数据,完成整个定量蛋白质组学/多肽组学数据工作。
[0029]现代生物质谱技术的发展几乎是和分辨率的提高同步的,其中orbitrap类的质谱技术现在已经成为高分辨率质谱的典型代表。Maxquant算法只能和高分辨率质谱的蛋白质组学/多肽组学数据配合使用,本实验采用的最新一代的orbitrap质谱(Q-exactive)采集
LCMS/MS数据。Q-exactive能够达到定量和定性的完美结合.MSI和MS2的采集都是高分辨的,其中MSI的分辨率可以达到140,000(日常工作为70,000),更难得的是MS2的日常工作分辨率也可以达到17,500。MS2采用的HCD模式,没有所谓“三分之一”规则,可以完美展现MS2的全部信息。
[0030]以下实施例中采用的化学试剂,例如TCA(三氯乙酸)、丙酮、TFA(三氟乙酸)等均能够通过购买得到。其中TCA和TFA均购自上海阿拉丁生化科技有限公司。丙酮等购自国药集团,为色谱级。
[0031]实施例1
[0032]一种植物体内源肽的提取方法,包括如下步骤:
[0033]利用液氮将放置在研钵中的植物组织冰冻后,研磨成粉末,研磨2min,并将粉末装入2mL的离心管中,待用;植物组织为新鲜的玉米叶片;
[0034]将装有粉末的离心管置于95。C的水浴中加热5min后,待用;
[0035]再向粉末中加入TCA和丙酮的混合溶液,粉末与混合溶液的比例为lg:6mL;沉淀5h后,4。C且lOOOOr/min下离心20min,收集沉淀物,待用;其中TCA和丙酮混合液共lOmL,且每lOmL的丙酮中溶解有lg TCA。[0036]将沉淀物用预冷的丙酮洗涤至无色后,将沅淀物复溶于溶解有蛋白酶抑制剂的TFA水溶液,且TFA水溶液中TFA的体积分数为1%;沉淀物与TFA水溶液的比例为lg:5mL,所述TFA水溶液与蛋白酶抑制剂的比例为ImL:5uL;然后于4。C下孵育th,得到第一混合溶液,待用;其中所用蛋白酶抑制剂是产自美国密苏里州西格玛奥德里奇公司的蛋白酶抑制剂;[0037]再将第一混合溶液通过低温冷却液循环泵降温下超声裂解5min,得到第二混合溶液,待用,其中超声功率为40W,每超声6s停止超声8s,裂解温度为8。C;
[0038]再将所述第二混合溶液在4。C且lOOOOr/min下离心20min,得到上清液,待用;[0039]再将所述上清液过lOkD的超滤管,得到的超滤液即为含有植物体内源肽的提取液;
[0040]将含有植物源内源肽的提取液脱盐处理后,真空干燥,得到肽段。
[0041]利用固相萃取的原理,采用针柱的方法进行脱盐。所用产品为美国密苏里州西格玛奥德里奇公司的产品针柱C18,内径7mm,容量3ml。
[0042]上述提取方法重复三次,记录为第1组、第2组和第3组,且分别对这三组得到的肽段进行检测。
[0043]以下是对上述植物体内源肽的提取方法提取得到的植物体内源肽的检测方法。
[0044]具体检测方法为:
[0045]将2ug的肽段复溶于体积分数为0.10/ 2mL的TFA水溶液中,得到待测样品;
[0046]再将待测样品进行LC-MS/MS分析。
[0047]采用纳升流速HPLC液相系统进行分离。液相A液为0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为2/0),B液为0.10/甲酸乙腈水溶液(乙腈为84%)。
色谱柱(ThermoEASY column SC200 150um~lOOmm (RP-C18))以100%的A液平衡。样品由自动进样器上样到ThermoASYcolumnSCOOltraps150um~20mm (RP-C18),再经色谱柱分离,流速为300nL/min。相关液相梯度如下:Omin~115min,B液线性梯度从0%~45%;115min~117min,B液线性梯度从45%~100%;117min~120min,B液维持在100%。酶解产物经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。分析时长:120min,检测方式:正离子,母离子扫描范围:300m/zN1800m/z,多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集:MS1在M/2200时分辨率为70,000,AGCtarget:3e6,——级MaximumIT:lOms,Numberofscanranges:1,Dynamicexclusion:40. Os;每次全扫描后采集20个碎片图谱,二级在M/Z 200时分辨率为1 7,500,MS/MSActivation模式:HCD,Isolationwindow:2m/z,Microscans:1,二级MaximumIT: 60ms ,Normalizedcollisionenergy: 30eV, Underfillratio:0.1%.
[0048]采用LC-MS/MS方法对上述3次的提取液进行检测的结果如表1,从表1能够看出三次分别鉴定到2607、2606、2594条肽段。共计鉴定肽段2620条,对应蛋白527个。对这些肽段得分进行统计,提取到的肽段得分较高,说明该方法提取到的肽段质量较好,如图1所示。对
这些肽段长度进行统计,提取到的多肽长度在8-25范围内,且大致呈正态分布如图2所示。
[0049]表1质谱鉴定到肽段数量和蛋白数量统计
第1组第2组笫3组
各重复肽段数260726062594
[0050]
总肽段数2620
对应蛋白数527
[0051]对比例l
[0052]一种植物体内源肽的提取方法,包括如下步骤:
[0053]利用液氮将放置在研钵中的植物组织冰冻后,研磨成粉末,研磨2min,并将粉末装入2mL的离心管中,待用;植物组织为新鲜的玉米叶片;
[0054]在粉末中加入溶解有蛋白酶抑制剂的TFA水溶液,且TFA水溶液中TFA的体积分数为1%;沉淀物与TFA水溶液的比例为lg:5mL,TFA水溶液与蛋白酶抑制剂的比例为ImL:5uL;然后于4。C下孵育th,得到第一混合溶液,待用;
[0055]再将第一混合溶液通过低温冷却液循环泵降温下超声裂解5min,得到得到第二混合溶液,待用,其中超声功率为40W,每超声6s停止超声8s;
[0056]再将所述得到第二混合溶液在4。C且lOOOOr/min下离心20min,得到上清液,待用;
[0057]再将所述上清液过lOkD的超滤管,得到的超滤液即为含有植物体内源肽的提取液;
[0058]将含有植物源内源肽的提取液脱盐处理后,真空干燥,得到肽段。
[0059]上述提取方法重复三次,记录为第1’组、第2’组和第3’组,且分别对这三组得到的肽段进行检测。
[0060]以下是对上述植物体内源肽的提取方法提取得到的植物体内源肽的检测方法。
[0061]具体的检测方法与实施例l的检测方法相同,检测结果为:
[0062]采用LC-MS/MS方法对上述3组的肽段进行检测的结果如表2,从表2能够看出三次分别鉴定到1125、969、1089条肽段。共计鉴定肽段1400条,对应蛋白382个。对这些肽段得分进行统计,提取到的肽段得分较低,说明该方法提取到的肽段质量较差,如图3所示。对这些肽段长度进行统计,提取到的多肽长度在8-25范围内,且大致呈正态分布如图4所示。
[0063]表2质谱鉴定对比例1的三组肽段数量和蛋白数量统计
[0064]第1’组第2’组第3’组各重复肽段数11259691 089总肽段教1400对应蛋白数3 82
[0065]通过将实施例1与对比例1的结果相对比,发现本发明方法操作简便,并且有效的保留植物体内天然长链肽,因此本发明的提取方法产率高,获得的肽段数目多,且肽段长度长。
[0066]实施例2
[0067]一种植物体内源肽的提取方法,包括如下步骤:
[0068]利用液氮将放置在研钵中的植物组织冰冻后,研磨成粉末,研磨2min,并将粉末装入2mL的离心管中,待用;植物组织为新鲜的玉米叶片;
[0069]将装有粉末的离心管置于94.5。C的水浴中加热4min后,待用;
[0070]再向粉末中加入TCA和丙酮的混合溶液,粉末与混合溶液的比例为lg:5mL;沉淀4.5h后,3。C且9000r/min下离心18min,收集沉淀物,待用;其中TCA和丙酮混合液共lOmL,且每lOmL的丙酮中溶解有lg TCA。
[0071]将沉淀物用预冷的丙酮洗涤至无色后,将沉淀物复溶于溶解有蛋白酶抑制剂的TFA水溶液,且TFA水溶液中TFA的体积分数为1%;沉淀物与TFA水溶液的比例为lg:4mL,TFA水溶液与蛋白酶抑制剂的比例为ImL:4uL;然后于3。C下孵育0.8h,得到第一混合溶液,待
用;其申所用蛋白酶抑制剂是产自美国密苏里州西格玛奥德里奇公司的蛋白酶抑制剂;
[0072]再将第一混合溶液通过低温冷却液循环泵降温下超声裂解4min,得到第二混合溶液,待用,其中超声功率为40W,每超声5.5s停止超声7.5s,裂解温度为4。C;
[0073]再将所述第二混合溶液在3。C且9000r/min下离心18min,得到上清液,待用;
[0074]再将所述上清液过lOkD的超滤管,得到的超滤液即为含有植物体内源肽的提取
液;
[0075]将含有植物源内源肽的提取液脱盐处理后,真空干燥,得到肽段。
[0076]实施例3
[0077]一种植物体内源肽的提取方法,包括如下步骤:
[0078]利用液氮将放置在研钵中的植物组织冰冻后,研磨成粉末,研磨2min,并将粉末装入2mL的离心管中,待用;植物组织为新鲜的玉米叶片;
[0079]将装有粉末的离心管置于95.5。C的水浴中加热5min后,待用;
[0080]再向粉末中加入TCA和丙酮的混合溶液,粉末与混合溶液的比例为lg:7mL;沉淀5.5h后,5。C且llOOOr/min下离心22min,收集沉淀物,待用;其中TCA和丙酮混合液共lOmL,且每lOmL的丙酮中溶解有lg TCA。
[0081]将沉淀物用预冷的丙酮洗涤至无色后,将沉淀物复溶于溶解有蛋白酶抑制剂的TFA水溶液,且所述TFA水溶液中TFA的体积分数为1%;沉淀物与所TFA永溶液的比例为lg:6mL,TFA水溶液与蛋白酶抑制剂的比例为ImL:6uL;然后于5。C下孵育1.2h,得到第一混合溶液,待用;其中所用蛋白酶抑制剂是产自美国密苏里州西格玛奥德里奇公司的蛋白酶抑制剂;
[0082]再将第一混合溶液通过低温冷却液循环泵降温下超声裂解5min,得到第二混合溶液,待用,其中超声功率为40W,每超声6.5s停止超声8.5s,裂解温度为10。C;
[0083]再将所述第二混合溶液在5。C且llOOOr/min下离心22min,得到上清液,待用;
[0084]再将所述上清液过lOkD的超滤管,得到的超滤液即为含有植物体内源肽的提取液;
[0085]将含有植物源内源肽的提取液脱盐处理后,真空干燥,得到肽段。
[0086]以上公开的仅为本发明的较佳实施例,但是,本发明实施例并非局限于此,任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
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